Окраска микроорганизмов

Окраска по цилю-нильсену-100

КУПИТЬ

Инструкция для печати (в формате pdf)

ИНСТРУКЦИЯ

по применению набора реагентов для окраски микроорганизмов по методу Циля-Нильсена (с фуксином)

НАЗНАЧЕНИЕ

Набор реагентов предназначен для диагностической окраски микроорганизмов в мазках (гной, мокрота, моча и др.) и выявления в них кислотоустойчивых

бактерий (Mycobacterium tuberculosis и Mycobacterium leprae). Набор

может применяться в клинико-диагностических лабораториях, а так же в научно-

исследовательской практике.

Набор реагентов рассчитан на проведение 100 определений при расходе по 1,0 мл рабочего раствора красителей на один анализ. Процедура окрашивания

мазков не превышает 10 минут.

ПРИНЦИП МЕТОДА

Кислотоустойчивые бактерии, из-за наличия в их клетках липидов, восков и оксикислот, после окраски их раствором фуксина Циля при нагревании прочно связывают фуксин, прокрашиваются в красный цвет и не обесцвечиваются кислотным раствором спирта. Все остальные окрашенные микроорганизмы обесцвечиваются и дополнительно окрашиваются раствором метиленового

синего в синий цвет.

СОСТАВ НАБОРА

1. Раствор метиленового синего (метиленовый синий – 5 г/л, спирт

этиловый – 10%), 100 мл – 1 флакон.

2. Раствор солянокислого спирта (концентрат) 10 мл – 1 флакон.

3. Раствор фуксина Циля (фенол – 50 г/л, основной фуксин – 10 г/л, спирт

этиловый 10%), 100 мл – 1 флакон.

МЕРЫ ПРЕДОСТОРОЖНОСТИ

Раствор фуксина по Цилю содержит в своем составе едкое вещество – фенол. Раствор солянокислого спирта содержит раздражающие вещества – соляную кислоту. В случае попадания этих растворов на кожу и (или) слизистые необходимо сразу же промыть пораженное место большим количеством воды. Пипетирование per os категорически запрещается.

При работе с биологическим материалом человека необходимо соблюдать правила техники безопасности принятые в бактериологической лаборатории, т.к. любые исследуемые образцы биологического материала следует рассматривать как потенциально инфицированные.

ОБОРУДОВАНИЕ И РЕАГЕНТЫ:

– спиртовка или газовая горелка;

– секундомер или песочные часы;

– вода дистиллированная;

– спирт этиловый 96%;

– перчатки резиновые или пластиковые.

АНАЛИЗИРУЕМЫЕ ОБРАЗЦЫ

Моча, мокрота, спинномозговая жидкость, серозные жидкости полостей.

ПОДГОТОВКА РЕАГЕНТОВ ДЛЯ АНАЛИЗА

Раствор метиленового синего и раствор фуксина Циля – готовы к применению.

Рабочий раствор солянокислого спирта – готовиться путем смешения 10 мл концентрата раствора солянокислого спирта и 90 мл спирта этилового 96%.

Предметные стекла перед использованием необходимо тщательно вымыть и обезжирить. Нанести на стекло мазок исследуемой биологической жидкости (мокрота, мочи и т.д.) и высушить его на воздухе. Мазок зафиксировать химическим или физическим способом. Приготовленные мазки должны быть правильной толщины. Слишком тонки мазки могут привести к ложноотрицательному

результату, а толстые плохо фиксируются и прокрашиваются.

ПРОВЕДЕНИЕ АНАЛИЗА

2. Внести предметное стекло с препаратом в небольшое пламя горелки и греть до появления паров. Стекло вынуть из пламени и дать слегка остыть.

3. Процедуру по Пункту 2. повторить еще 2 раза

Важно, процедуру прогрева проводить так, что бы к концу 3 раза фильтровальная бумага оставалась влажной!

4. Подогретый мазок оставить остывать на 5 минут для более полного окрашивания клеточной системы бактерий.

6. Мазок поместить в солянокислый спирт или налить на поверхность стекла для обесцвечивания. Обесцвечивать до полного удаление краски (около 3 минут). Тщательно промыть дистиллированной водой.

7. Докрасить препарат путем нанесения на препарат раствора метиленового синего

Важно не перекрасить! Время окраски может занимать от 30 секунд до 1 минуты

8. Стекло с препаратом промыть дистиллированной водой.

9. Высушить на открытом воздухе при комнатной температуре. Микроскопировать под масляной иммерсией.

Набор должен храниться в упаковке предприятия-изготовителя при температуре +2–25° С в течение всего срока годности.

Рабочий раствор солянокислого спирта и раствор метиленового синего после вскрытия хранить в плотно укупоренной таре при температуре +18–25° С не более 6 месяцев.

Раствор фуксина Циля после вскрытия флакона можно хранить в течение всего срока годности набора.

Срок годности набора – 1 год.

По вопросам, касающимся приобретения наборов и их качества, просим обращаться по адресу: 105173, г. Москва, ул. Западная, д. 2, стр. 1, ООО «Агат–Мед». Телефон для справок: (495) 777-41-92.

Назад к списку инструкций

Бизнес и финансы

БанкиБогатство и благосостояниеКоррупция(Преступность)МаркетингМенеджментИнвестицииЦенные бумагиУправлениеОткрытые акционерные обществаПроектыДокументыЦенные бумаги — контрольЦенные бумаги — оценкиОблигацииДолгиВалютаНедвижимость(Аренда)ПрофессииРаботаТорговляУслугиФинансыСтрахованиеБюджетФинансовые услугиКредитыКомпанииГосударственные предприятияЭкономикаМакроэкономикаМикроэкономикаНалогиАудитМеталлургияНефтьСельское хозяйствоЭнергетикаАрхитектураИнтерьерПолы и перекрытияПроцесс строительстваСтроительные материалыТеплоизоляцияЭкстерьерОрганизация и управление производством

фундамент

В основе этой техники окрашивания лежат свойства клеточных стенок этих микроорганизмов. Стенка образована жирными кислотами, называемыми миколиновой кислотой; Они характеризуются очень длинными цепями.

Когда жирные кислоты имеют очень длинную структуру, они могут легче удерживать красители. Некоторые роды бактерий очень трудно окрашивать по Граму, из-за высокого содержания миколевой кислоты в клеточной стенке.

В окраске Циля-Нильсена используется фенольное соединение карбол-фуксин, основной краситель. Это имеет способность взаимодействовать с жирными кислотами клеточной стенки, которая имеет восковую текстуру при комнатной температуре.

Окрашивание карболом фуксина улучшается в присутствии тепла, потому что воск плавится и молекулы красителя быстрее перемещаются в клеточную стенку.

Кислота, которая используется позже, служит для обесцвечивания клеток, которые не были окрашены, потому что их стенка была недостаточно связана с красителем; следовательно, прочность кислотного обесцвечивателя способна удалять кислотный краситель. Клетки, которые противостоят этому обесцвечиванию, называются кислотоустойчивыми.

Вторичная окраска

После обесцвечивания образца это контрастирует с другим красителем, называемым вторичным красителем. Обычно используется метиленовый синий или малахитовый зеленый.

Вторичный краситель окрашивает фоновый материал и, следовательно, создает контраст со структурами, которые были окрашены на первом этапе. Только обесцвеченные клетки поглощают второй краситель (против пятен) и приобретают свой цвет, в то время как кислотостойкие клетки сохраняют красный цвет.

Эта процедура часто используется для идентификации Микобактерии туберкулеза и Mycobacterium leprae, которые называются кислотоустойчивыми бациллами.

Морфология грибов.

Грибы
и простейшие имеют четко ограниченное
ядро и относятся к эукариотам. Грибы
крупнее бактерий, в эволюционном плане
близки к растениям (наличие клеточной
стенки, содержащей хитин или целлюлозу,
вакуолей с клеточным соком, неспособность
к перемещению, видимое движение
цитоплазмы). Ядерный материал грибов
отделен от цитоплазмы ядерной мембраной.
Дрожжевые
грибы образуют отдельные овальные
клетки. Плесневые
грибы формируют клеточные нитеподобные
структуры- гифы.
Мицелий
переплетение гифов- основная морфологическая
структура. При вегетативном размножении
образуются специализированные
репродуктивные структуры- споры- конидии.
Они могут располагаться в специализированных
вместилищах- спорангиях
(эндоспоры) или отшнуровываться от
плодоносящих гиф (экзоспоры). Актиномицеты
— формы бактерий, имеющие истинный, не
имеющий перегородок мицелий. Мицелиальный
(в виде ветвящихся нитей) рост этих
грамположительных бактерий придает им
внешнее сходство с грибами. Это сходство
усиливается вследствие наличия у высших
форм актиномицетов наружных неполовых
спор, которые называются конидиями.В
отличие от грибов, актиномицеты имеют
прокариотическое строение клетки, не
содержат в клеточной стенке хитина или
целлюлозы, размножаются только бесполым
путем. Представители рода Mycobacterium,
в который входят возбудители туберкулеза,
являются кислотоустойчивыми
микроорганизмами, плохо воспринимающими
краски. Их высокая резистентность во
внешней среде , кислотоустойчивость и
ряд других свойств связан с особым
составом клеточной стенки, большим
содержанием липидов и воска.У представителей
родов Actinomyces
и Nocardia
мицелий выражен в значительно большей
степени, чем у микобактерий, однако в
старых культурах они также проявляют
тенденцию фрагментироваться на отдельные
клетки неправильной формы. Микроорганизмы
рода Actinomyces
являются анаэробами, Nocardia
— аэробами, многие из которых проявляют
кислотоустойчивость. Микроорганизмы,
относящиеся к высшим актиномицетам
(рода Streptomyces,
Micromonospora)
образуют мицелий и размножаются наружными
неполовыми спорами или конидиями.
Обычным местом обитания для большинства
из них является почва.

1)
Архимицеты
– наиболее примитивные, микроскопических
размеров; зачаточный мицелий или нет
мицелия; тело представляет собой голый
комочек протоплазмы, который покрывается
оболочкой в процессе превращения в
спорангий; размножаются бесполым путем
посредством подвижных спор – зооспор,
развивающихся в спорангие. Явл.
внутриклеточными паразитами низших и
высших растений. Z.B.
Ольпидиум Olpidium
brassicae;
Синхитриум Synchytrium
endobioticum.

2)
Фикомицеты
– хорошо развитый одноклеточный,
многоядерный мицелий; бесполое размножение
происходит при помощи неподвижных
спорангиеспор или подвижных зооспор,
при половом процессе образуется зигота.
Z.B.
Фитофтора Phytophthora
infenstans;
Мукор Mucor;
Ризопус Rhizopus/

3)
Аскомицеты
– сумчатые грибы, мицелий многоклеточный,
состоит из многоядерных клеток. Бесполым
путем размножаются при помощи конидий;
при половом процессе образуются аскоспоры
в сумках (асках). Голосумчатые – не
образуют плодовые тела Z.B.
эндомицес Enlomyces.
Плодосумчатые — образуют плодовые тела
Z.B.
пенициллиум Penicillium;
аспергилловые Aspergillus
niger,
awamori.

4)
Базидиомицеты
– бесполое размножение редко; основными
органами размножения являются базидии
с базидиоспорами. а) Одноклеточные
базидии: базидии развиваются слоями на
плодовых телах Z.B.
шляпочные, трутовики, домовые грибы.
б) Многоклеточные базидии
– большинство не имеет плодовых тел;
Z.B.
головневые грибы; ржавчинные грибы.
Явл. основной массой съедобных грибов
р. Boletus,
Вешенки, шампиньоны – немикаридные, не
нуждаются в симбиозе с высшими растениями,
могут выращиваться на экстрактах.

5)
Несовершенные
грибы –
многоклет. грибы, половое размножение
не обнаружено; боль-во размножается
конидиями, некоторые образуют оидии,
другие способны к почкованию или не
имеют спец. органов размножения. Z.B.
фузариум, ботритис, оидиум и др.

Применение:
1) экологическое (цикл С); 2) отрицательная
роль: многие грибы вызывают биоразрушения,
выделяя экзоферменты (резина, древесина),
3) биотехнологическое: получение орг.
к-т, антибиотиков, сыров, ферментов.

2.3. Методы окраски спор у бактерий

Споры бактерий по
сравнению с вегетативными клетками
обладают высокой устойчивостью к
неблагоприятным
условиям внешней среды.

При наблюдении за
живыми спорообразующими бактериями их
споры можно различить по более сильному
преломлению световых лучей. Споры
кислотоустойчивы, поэтому с трудом
окрашиваются красителями. Объясняется
это большой плотностью оболочки, низкой
концентрацией в ней свободной воды и
высоким содержанием липидов в спорах.
В препаратах, окрашенных простыми
способами или по Граму, споры остаются
бесцветными (негативная
окраска).

В связи с особенностями
физико-химического состава и плотной
малопроницаемой оболочкой на первом
этапе окраски спор применяют химические
вещества, изменяющие структуру их
оболочки. Однако при последующем
прокрашивании споры одновременно
прокрашивается и цитоплазма клетки,
поэтому под микроскопом последняя
выглядит однородно окрашенной. Для того
чтобы на препарате оставались прокрашенными
только споры, следует такой «перекрашенный»
препарат частично обесцветить, забирая
краситель у цитоплазмы и оставляя его
в споре. Этого достигнуть нетрудно, так
как краситель, адсорбированный спорой,
удерживается прочнее, чем поглощенный
цитоплазмой клетки.

Таким образом, все
способы окраски спор основаны на едином
принципе:
сначала
споры протравливают различными
веществами: хромовой, соляной, серной,
уксусной кислотами, аммиаком, едким
натром или перекисью водорода, затем
окрашивают клетку со спорой при нагревании
и, наконец, обесцвечивают цитоплазму и
дополнительно окрашивают ее контрастным
красителем.

Нарисуем невидимое, или Методы окраски микроорганизмов

Мы живем в мире бактерий. Они вокруг нас и внутри нашего организма. Не удивительно, что мы хотим знать о них как можно больше. Но как рассмотреть и тем более изучить что-то настолько маленькое? Микроскоп, казалось бы, должен решить эту проблему. Но не все так просто – в своем естественном состоянии микроорганизмы прозрачны как стекло. «Проявить» картинку помогают различные методы окраски бактерий, помогающие исследовать внешнее и внутреннее строение микробов.

Как все начиналось

В конце девятнадцатого века датский биолог Кристиан Грам предложил решение этой проблемы. Если что-то невидимо, его нужно покрасить и посмотреть, что получится. Метод окраски бактерий, предложенный Грамом, был настолько убедителен, что и по сей день микроорганизмы разделяют на грамположительные (удерживающие окраску) и грамотрицательные (обесцвечивающиеся после обработки спиртом).

Старый – не значит плохой

Пожалуй, самый практичный и широко применяемый способ окрашивания микроорганизмов – метод Грама. Мазок, зафиксированный огнем, покрывают метиловым фиолетовым красителем, фиксируют йодом, просушивают и промывают спиртом. На этом этапе, в зависимости от свойств клеточной мембраны, бактерии становятся:

  • ярко-синими (грамположительные);
  • бесцветными (грамотрицательные).

Витальные методы окраски

По состоянию исследуемых организмов в микробиологии существуют:

  • витальный способ, т. е. работа с живыми бактериями (опасен, требует строгого соблюдения техники безопасности);
  • поствитальный метод – работа с фиксированными (убитыми) клетками;
  • негативный, может быть витальным и поствитальным, удобен для работы с капсулами.

Работа с фиксированными препаратами

Белым по черному

Еще одна разновидность окраски бактерий основана на свойствах негатива, т. е. на темном фоне препарата четко видны бесцветные бактерии, иными словами, окрашивается среда, а не сам организм.

Иногда бактерии, попадая в определенные условия, образуют капсулы. Это слизистые образования, покрывающие клетку, чем-то похожие на гель. Капсулы прозрачны, их химический состав может сильно отличаться у разных видов бактерий, т.е. просто покрасить и оценить результат по получившемуся цвету не выйдет.

Окраска спорообразующих бактерий

Если говорить о клеточных оболочках, то нельзя не вспомнить о спорообразующих бактериях. Споры образуются при неблагоприятных для клетки условиях и могут существовать в агрессивной среде довольно длительное время. То, что хорошо для сохранения клетки, плохо для ее изучения. Споры очень плотные и почти не пропускают жидкости, кроме того, они кислотоустойчивы. Следовательно, простое окрашивание или метод Грама оставят споры бесцветными.

Как рассмотреть бактериальные жгутики

Еще одна непростая задача – окраска бактерий со жгутиками. Это спирально закрученные очень тонкие нити, которые микроорганизмы используют для перемещения. Жгутики необычайно тонкие, при окрашивании они легко отрываются от клетки. Поэтому перед началом окрашивания жгутики протравливают, искусственно увеличивая в объеме.

Техника окрашивания

Для получения окрашенного препарата нельзя просто взять кисточку, краски и отловить бактерию. Существует определенная схема работы с микроорганизмами:

  1. Приготовление мазка. На предметное стекло (стерильное) наносят каплю воды, в которую затем бактериологической петлей вносят и распределяют по поверхности лабораторный материал.
  2. Высушивание. Лишняя жидкость высушивается либо естественным путем при комнатной температуре, либо мазок немного прогревается высоко над пламенем горелки.
  3. Фиксация. Мало просто убрать воду, нужно закрепить бактерии на предметном стекле. Для этого можно использовать огонь (несколько проходов над самой горячей частью пламени) или жидкость (спирт, ацетон). После такой обработки микроорганизмы быстрее впитывают краску.
  4. Непосредственно окрашивание. Краска должна полностью покрывать всю поверхность мазка. Выдержав нужное время (для каждого красителя свое), краску убирают и промывают препарат водой.

Приготовление[править | править код]

Реактивы

  • спирт этиловый 96- марки ОП-2, ТУ 6-09-4512-77;
  • кислота соляная концентрированная, ГОСТ 3118-77;
  • кислота серная концентрированная, ГОСТ 4204-77;
  • фенол кристаллический (карболовая кислота), ГОСТ 6417-72;
  • фуксин основной, ТУ 6-09-3804-82;
  • метиленовый синий хлорид, ТУ 6-09-945-75;
  • глицерин, ЧДА, ГОСТ 6259-75;
  • вода дистиллированная, ГОСТ 6709-72.

Приготовление растворов

Раствор 1. Насыщенный спиртовой раствор фуксина:

растереть в ступке 0,3 г основного фуксина с 2 — 3 каплями глицерина, добавить по каплям 10 мл 96- этилового спирта.

Раствор 2. Рабочий раствор фенола (5 % водный раствор):

расплавить 5 г кристаллического фенола путём легкого подогревания на водяной бане (температура плавления фенола 41 °C). Добавить слегка подогретую дистиллированную воду до объема 100 мл.

Раствор 3. Рабочий раствор карболового фуксина:

в 90 мл полученного раствора фенола (2) добавить 10 мл насыщенного раствора фуксина (1).

Раствор 4. Обесцвечивающие растворы:

а) Раствор серной кислоты

Никогда не добавляйте воду в кислоту!

б) Раствор солянокислого спирта

растворить 0,3 г хлорида метиленового синего в 100 мл дистиллированной воды.

Методы окраски препаратов. Окраска по методу Синева и метиленовым синим

В лаборатории применяются анилиновые краски, приготавливаемые из анилина и других производных каменноугольного дегтя. Для окраски препаратов применяются основные и кислые краски. Основные краски хорошо воспринимаются микробами и ядерным хроматином. Кислые краски хорошо окрашивают протоплазму и слабее микроорганизмы.

Кислыми красителями называются свободные окрашенные кислоты или соли этих кислот, обычно соли натрия. Основные красители — это соли красящих оснований, чаще всего хлоргидраты.

Насыщенные спиртовые растворы красок, из которых готовят рабочие краски, хранят в стеклянных банках с притертой пробкой.

Изготовление растворов заключается в следующем.

В флакон с притертой пробкой насыпают 10 г сухой краски, наливают 100 мл 96° спирта ректификата и при ежедневном взбалтывании оставляют раствор на несколько дней, после чего эта краска может быть употреблена для спирто-водных растворов, необходимых для окраски препаратов.

Наиболее часто употребляющиеся растворы красок:

Разведенный фуксин (фуксин Пфейффера)

10 мл карболового фуксина Циля, 90 мл дистиллированной воды. Этот раствор при хранении портится, поэтому его готовят по мере надобности и хранят не более суток.

Карболовый раствор кристалл-виолета

Краски — 1 г Спирта ректификата 96°— 10 мл Кристаллической карболовой кислоты — 2 г Дистиллированной воды — 100 мл

Краску растирают с карболовой кислотой, добавляя спирт, а потом дистиллированную воду, через сутки фильтруют.

Примечание. Вместо кристалл-виолета можно пользоваться насыщенными растворами метил-виолета либо генцианвиолета. Последний при окрашивании выпадет в осадок, в практике он менее применим.

Окраска по методу Синева

Для окраски применяются кусочки фильтровальной бумаги, пропитанные спиртовым раствором краски. Листы фильтровальной бумаги, разложенные на стекле, обливают 1—2% раствором (в 96° спирте) краски и затем окрашенную высушенную бумагу разрезают на кусочки размером 2X4 см и сохраняют в стеклянных темных банках с притертой пробкой. Приготовленные таким способом бумажки не теряют окрашивающих свойств весьма продолжительное время. Приготовленные препараты красятся в зависимости от исследуемого материала простым либо сложным методом.

К простому методу относится: окраска разведенным фуксином (фуксином Пфейффера), окраска щелочной метиленовой синькой. Окраска разведенным фуксином. На приготовленный на предметном стекле фиксированный на пламени и остывший исследуемый препарат наливают на 1—2 минуты разведенный фуксин. Затем препарат промывают водой и высушивают на воздухе.

Окрашивание метиленовой синькой. На приготовленный, высушенный и фиксированный мазок наливают пипеткой метиленовую синьку на 2—3 минуты, после чего препарат смывают водой и высушивают.

Ядра при этом окрашивании более интенсивно воспринимают окраску и резко выделяются над протоплазмой, которая окрашивается слабее.

К сложным методам окраски относятся окрашивания одного и того же препарата растворами нескольких красок в определенном порядке для дифференциации микробов вследствие их сродства к определенным краскам.

В число сложных методов входят: окраска кислотоустойчивых микробов по Циль-Нильсену, окраска по Граму, окраска па Романовскому-Гимза и другие.

— Читать далее «Окраска кислотоустойчивых микробов. Окраска микробов по Граму»

Оглавление темы «Микроскопия и подготовка препаратов к микроскопии»: 1.

Микроскопическое исследование. Подготовка материала для микроскопического исследования2. Темнопольная микроскопия. Техника темнопольной микроскопии3. Фазово-контрастная микроскопия. Техника фазово-контрастной микроскопии4. Подготовка материала для электронной микроскопии.

Подготовка материала к окраске5. Методы окраски препаратов. Окраска по методу Синева и метиленовым синим6. Окраска кислотоустойчивых микробов. Окраска микробов по Граму7. Окраска по Романовскому-Гимза. Окраска спор8. Приготовление питательных сред. Требования к питательным средам9. Взятие малых количеств крови. Как брать кровь из пальца для исследований?10. Приготовление мазков крови.

Взятие крови для определения СОЭ

1 2   3   4   5   6   7   8   9   …   40

Метод циля-нильсена

  1. На
    фиксированный препарат + фильтровальная
    бумага + фуксин Циля. Подогреваем до
    отхождения паров + краситель (2 раза)

  2. Н2О

  3. 5%
    Н24
    (погружая
    2-3 раза)

  4. Н2О

  5. Метиленовый
    синий 1 % — 3-5 мин

  6. Н2О

  7. Микроскопия
    с иммерсией.

Кислотоустойчивые
бактерии окрашиваются в красный цвет,
остальные – в синий (рис. № 4,5).

Рис.
№ 5
Mycobacterium
tuberculosis  в мокроте

ПРАКТИЧЕСКОЕ
ЗАНЯТИЕ №3

Выявление
капсул по методу Бурри, Бурри-Гинса.

Студент
должен иметь представления:


негативные методы окраски.

Студент
должен знать:


методы микробиологических исследований,


виды микроскопии, их особенности,


строение, состав и функции капсулы,


капсулообразование как фактор
патогенности,


примеры капсульных микробов,


особенности фиксации и окраски по методу
Бурри и Бурри-Гинса, красители и реактивы,


цель применения и сущность метода.

Студент
должен уметь:


выявление капсул у бактерий методом
Бурри – Гинса,

-микроскопия
окрашенных препаратов с использованием
иммерсионной системы,


соблюдение мер безопасной работы с
живыми культурами микробов,


обработка рабочего места и рук дез.
веществами.

Этапы
самостоятельной аудиторной работы:

  1. Подготовить
    препарат из культуры и окрасить его по
    методу Бурри-Гинса

  2. Препараты,
    подготовленные и демонстрационные,
    промикроскопировать с иммерсией

  3. Обработать
    рабочие места и руки

  4. Зарисовать
    результаты микроскопирования и записать
    алгоритм метода в дневник

ОБНАРУЖЕНИЕ
КАПСУЛ У БАКТЕРИЙ

Некоторые
микробы обладают способностью откладывать
на поверхности своего тела мощный
слизистый слой вокруг клеточной стенки.
Его называют капсулой.
В состав капсул входят, главным образом,
полисахариды (пневмококк), но у некоторых
они содержат и полипептиды (палочка
сибирской язвы). Капсулы имеют консистенцию
геля, поэтому при микроскопии живых
бактерий они видны очень плохо. Для
обнаружения применяют негативную
окраску
.
При этом краситель заполняет пространство
вокруг бактерий, в результате чего они
выглядят светлыми частицами на темном
фоне.

Рис.
№6.

ПРИГОТОВЛЕНИЕ МАЗКА ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ
КАПСУЛЫ

Техника окрашивания

Для получения окрашенного препарата нельзя просто взять кисточку, краски и отловить бактерию. Существует определенная схема работы с микроорганизмами:

  1. Приготовление мазка. На предметное стекло (стерильное) наносят каплю воды, в которую затем бактериологической петлей вносят и распределяют по поверхности лабораторный материал.
  2. Высушивание. Лишняя жидкость высушивается либо естественным путем при комнатной температуре, либо мазок немного прогревается высоко над пламенем горелки.
  3. Фиксация. Мало просто убрать воду, нужно закрепить бактерии на предметном стекле. Для этого можно использовать огонь (несколько проходов над самой горячей частью пламени) или жидкость (спирт, ацетон). После такой обработки микроорганизмы быстрее впитывают краску.
  4. Непосредственно окрашивание. Краска должна полностью покрывать всю поверхность мазка. Выдержав нужное время (для каждого красителя свое), краску убирают и промывают препарат водой.

После высыхания (обычно естественным путем) полученный результат можно использовать по назначению.

Окрашивание микроорганизмов – это целая система методов, приемов, схем, направленных на обнаружение и распознавание клеток при помощи микроскопа. Ни одно медицинское исследование или научная работа в микробиологии не обходятся без предварительной подготовки и окраски изучаемого материала.

Процедура

Типичная процедура окрашивания AFB включает падение клеток в суспензии на предметное стекло, затем сушку жидкости воздухом и фиксацию клеток нагреванием.

Резюме кислотоустойчивого красителя (окраска Циля – Нильсена)
Применение Реагент Цвет ячейки
Кислотный быстро Безкислотный быстрый
Первичный краситель Карбол фуксин Красный Красный
Обесцвечивающее средство Кислый спирт Красный Бесцветный
Счетчик пятен Метиленовый синий / малахитовый зеленый Красный Синий

Исследования показали, что окрашивание AFB без посева имеет плохую прогностическую ценность. Культивирование КУБ необходимо проводить вместе с окрашиванием КУБ; это имеет гораздо более высокую отрицательную прогностическую ценность.

Механизм кислотостойкого окрашивания в кислотоустойчивых клетках и некислотных клетках.

Флуорохромирование аурамином

Техника.
Фиксированный препарат окрашивают
смесью аурамина 00 (0,12 г), карболовой
кислоты (5 мл), дистиллированной воды
(до 100 мл). Краситель нали­вают на мазок,
подогревают на пламени до появления
паров. Через 10 мин препарат промывают
водой и обесцвечивают 15 с солянокислым
спиртом. Препарат промывают и подсушивают
на воздухе.

Микроскопическая
картина.

Туберкулезные микобактерии флуоресцируют
золотисто-желтым цветом.

Окраска акридиновым
оранжевым

Техника.
Мазки, фиксированные 3-5 мин метиловым
спиртом, погружают в раствор (1:10000)
краси­теля, к 10 мл которого добавлено
3-5 капель 10% раствора ам­миака. Через
24 ч препарат обесцвечивают 3% солянокислым
спиртом (дважды по 10 с), промывают и
высушивают.

Микроскопическая
картина.

Туберкулезные микобактерии флуоресцируют
желто-оранжевым цветом.

Флуорохромирование
акридиновым желтым

Техника.
Мазок на 30 с помещают в водный раствор
(1:5000) флуорохрома, затем про­мывают.
Дифференцируют солянокислым спиртом
15 с, вновь про­мывают и высушивают.

Микроскопическая
картина.

Туберкулезные микобактерии флуоресцируют
желтым цветом.

Окраска спор

Бактериальные
споры, отличающиеся от вегетативных
клеток многослойной липидосодержащей
оболочкой, пропитанной депиколатом
кальция, не поддаются окраске простыми
методами и по Граму. Для окраски спор
разработаны специальные методы,
направленные на увеличение их проницаемости
с использованием растворов кислот,
концентрированных красителей и подогрева.

Способ Пешкова

Техника.
На мазок, фиксированный жаром (над
пламе­нем!), наливают синий Леффлера
и подогревают стекло до заки­пания
краски. Дают 15-20 с покипеть, а затем
(после того как стекло остынет!) промывают
водой и докрашивают препарат 30 с 0,5%
водным раствором нейтрального красного.
Вновь промы­вают, сушат и микроскопируют.

Микроскопическая
картина.

Споры окрашиваются в голу­бой цвет,
клетки – в розовый.

Способ Ганзена

Техника.
Препарат, приготовленный обычным
способом, при нагревании окрашивают
1-2 мин карболовым фуксином Циля, промывают
водой и обесцвечивают, погружая стекло
в 2% рас­твор азотной кислоты в спирте
или в 1 % водный раствор сер­ной кислоты.
Обесцвечивать надо так, чтобы на препарате
не было видно следов красителя. Затем
промывают водой и докра­шивают водным
раствором метиленового синего.

Микроскопическая
картина.

Споры окрашиваются в крас­ный цвет.

Метод Ожешки

Техника.
На нефиксированный мазок наливают 0,5%
рас­твор хлористоводородной кислоты
и подогревают 1-2 мин. С препарата сливают
кислоту, промывают его водой и после
высы­хания фиксируют на пламени.
Фиксированный препарат красят по способу
Циля-Нильсена.

Микроскопическая
картина.

Тела бактерий окрашиваются в синий
цвет, споры – в красный (рис.16).

Метод Виртца в
модификации Саватеева

Приготовление
растворов.

К насыщенному водному рас­твору
(около 5%) малахитового зеленого добавляют
5% глице­рина, пропитывают смесью
полоски фильтровальной бумаги и
вы­сушивают их (лучше при 50С).
Затем готовят 0,5% водный рас­твор
сафранина, которым смачивают другие
полоски фильтро­вальной бумаги и
высушивают.

Техника.
На фиксированный над пламенем мазок
наносят 2-3 капли дистиллированной воды
и накладывают по­лоску фильтровальной
бумаги, окрашенной малахитовым зеленым.
Препарат нагревают над пламенем горелки
до появления паров (3-4 раза), приблизительно
в течение минуты. При испарении воды ее
добавляют. После остывания препарата
краску с бумаж­кой смывают струей
воды (полминуты) и сейчас же на мокрую
поверхность препараты кладут бумажку,
окрашенную сафранином. Через 30-40 секунд
мазок промывают водой, высушивают и
микроскопируют.

Микроскопическая
картина.

Свободно лежащие споры – зе­леновато-голубого
цвета, споры внутри микробных клеток –
темно-зеленые, вегетативные формы
микробов – красные.

Как все начиналось

В конце девятнадцатого века датский биолог Кристиан Грам предложил решение этой проблемы. Если что-то невидимо, его нужно покрасить и посмотреть, что получится. Метод окраски бактерий, предложенный Грамом, был настолько убедителен, что и по сей день микроорганизмы разделяют на грамположительные (удерживающие окраску) и грамотрицательные (обесцвечивающиеся после обработки спиртом).

Как оказалось, клетки покрыты оболочкой, похожей на переплетенные между собой нити. И хотя в просветы между нитями свободно проходят питательные вещества, необходимые клетке, оболочка надежно защищает «внутренний мир» от внешних агрессивных факторов. У разных видов бактерий наружная стенка клетки имеет различную толщину, плотность и химический состав. Именно на этом свойстве клеточных оболочек базируется метод окраски по Граму.

Отталкиваясь от работ Кристиана Грама, биологи разработали новые методы, позволяющие не только определить форму и размер клеток, но и рассмотреть некоторые подробности их строения. Иногда микроорганизмы, совершенно идентичные по внешнему виду, по-разному реагируют на красители. Полученная информация дает возможность быстро и точно определить вид бактерий.

Оцените статью
Рейтинг автора
5
Материал подготовил
Андрей Измаилов
Наш эксперт
Написано статей
116
Добавить комментарий